概述

華鼎生物在抗體發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域深耕多年憋他，具有成熟完善的技術(shù)呆贿。能夠提供抗原制備糠亩、羊駝免疫舌狗、PBMC分離、cDNA制備俱两、抗體庫構(gòu)建篩選、納米抗體表達純化曹步、抗體人源化等一站式服務宪彩。

納米抗體的應用優(yōu)勢

• 用于臨床體外診斷（膠體金法、酶聯(lián)免疫吸附法讲婚、電化學發(fā)光法）尿孔；
• 用于生物醫(yī)藥研發(fā)（基因工程藥物研發(fā)、ADC藥物研發(fā)）
• 用于腫瘤研究筹麸、免疫學研究等基礎(chǔ)研究活合；申請具有自主知識產(chǎn)權(quán)的發(fā)明專利及科研獎項；
• 拓展研究思路物赶、發(fā)表國際知名學術(shù)刊物白指。

華鼎羊駝/駱駝單域抗體制備特色

• 羊駝/駱駝背景清晰：羊駝/駱駝健康適齡，可提供空白羊駝/駱駝進行免疫酵紫。
• 技術(shù)成熟：抗體庫容量可以達到10⁹,VHH抗體片段有效插入率﹥99%告嘲，并可以進行高通量篩選错维。
• 大規(guī)模制備：可利用原核/真核表達系統(tǒng)生產(chǎn)克級以上的抗體診斷原料。

羊駝免疫流程

服務步驟及交付標準

步驟	周期	交付材料
1.動物免疫
A.5次動物免疫 B.效價檢測 C.PBMC分離 D.RNA提取 E.cDNA制備	92天	5次免疫效價檢測數(shù)據(jù) 5次免疫之后的cDNA
2.構(gòu)建噬菌體抗體庫
A.利用免疫羊駝的cDNA橄唬，擴增出VHH基因片段赋焕，構(gòu)建M13單鏈絲狀噬菌體展示納米抗體免疫文庫; B.抗體庫質(zhì)量： （1）VHH抗體片段有效插入率﹥99%， （2）抗體庫容量達到109 C.從文庫中隨機挑取96個克隆仰楚，對其中30個克隆測序隆判，分析VHH抗體片段的多樣性和正確率，保證正確率≥80%僧界，另外提供30個克隆用于測序驗證蜜氨；	4-6周	提供質(zhì)檢報告與抗體庫 ①完整的項目報告和原始數(shù)據(jù)，報告需包含實驗流程捎泻、分析評估實驗的主要 操作步驟飒炎、以及詳細的實驗結(jié)果； ②共30個文庫隨機克隆的甘油菌和測序引物笆豁； ③噬菌體展示納米抗體免疫文庫的Kit（包含文庫甘油菌1ml × 10支和文庫噬菌粒質(zhì)粒10 μg）郎汪；
3.抗體庫篩選
A.篩選方案確定：根據(jù)項目實際情況，選擇不同的篩選方案闯狱，如競爭篩選煞赢，固相篩選，液相篩選哄孤，細胞篩選照筑，負篩選等篩選方法。 B.淘選： 對抗原蛋白進行SDS-PAGE分析驗證瘦陈，并進行生物素標記凝危；針對生物素化靶點蛋白，利用鏈霉親和素預包被的ELISA plates晨逝，淘篩免疫文庫蛾默；抗原施壓法進行2-3輪淘篩，確定充分富集且靶點篩選組的滴度要遠高于對照篩選組捉貌。 C.結(jié)合篩選：選擇從Output克隆中支鸡，分別挑取940個單克隆進行陽性克隆鑒定。經(jīng)培養(yǎng)和phage rescue后趁窃，進行monoclonal phage ELISA檢測牧挣。 D.測序分析:鑒定出抗原結(jié)合強陽性的VHH抗體克隆，測序分析醒陆，比對序列制作進化樹瀑构，選擇序列獨特的克隆统求； E.表達驗證：少量表達陽性VHH克隆检碗，利用soluble ELISA檢測對靶點抗原的特異性結(jié)合能力据块；	6-8周	10個以上的特異性克隆
4.納米抗體表達純化
A.將納米抗體基因克隆至真核或原核表達載體。	2周	高純度納米抗體100-500ug
5.親和力測定
采用Biacore 測定抗體的親和力/ 采用Nicoya LSPR 測定抗體的親和力/ 采用Fortebio octet 測定抗體的親和力	1周 1周 1周	親和力測定數(shù)據(jù)
6.納米抗體人源化（通過自主開發(fā)軟件AbsYs分析抗體可變區(qū)并進行抗體人源化設(shè)計折剃。）
A.識別FR另假、CDR、關(guān)鍵殘基怕犁、PTMs边篮。 B.通過同源比對，考慮可變區(qū)一致性及相似性奏甫、關(guān) 鍵殘基戈轿、PTMs、穩(wěn)定性等因素阵子，選擇更好的人源抗 體Germline FR作為模板思杯，與羊駝CDR 重組，設(shè)計初 始人源化抗體挠进。 C.分析抗體序列和結(jié)構(gòu)色乾，確定需要回復突變的關(guān)鍵 殘基，設(shè)計不同數(shù)量的回復突變VH领突。 D.將人源化基因克隆至真核表達載體暖璧，轉(zhuǎn)染293瞬時 表達獲得100-500ug 純化抗體。 E.結(jié)合活性及親和力檢測君旦。	6-8周	至少一個人源化抗體（親和力澎办、表達量與原納米抗體相當）

案例展示

本項目利用A和B蛋白抗原混合免疫2只羊駝，產(chǎn)生特異性針對A和B蛋白抗原高效的免疫反應金砍，并進行PBMC分離局蚀、RNA提取及cDNA制備，用于構(gòu)建納米抗體噬菌體文庫捞魁。

A抗原血清效價檢測結(jié)果

B-1（Fc tag）抗原血清效價檢測結(jié)果

B-2（his tag）抗原血清效價檢測結(jié)果

B-1（Fc tag）至会、B-2（his tag）抗原陽性對照抗體效價檢測結(jié)果

結(jié)論
本項目共免疫2只羊駝谱俭， 經(jīng)過5次免疫后檢測抗血清效價，結(jié)果顯示宵蛀，A, B-1（Fc tag）蛋白免疫動物后均產(chǎn)生了正常的免疫應答昆著。重鏈抗體的效價較總IgG的效價低，4免后效價達到最高术陶，建議結(jié)束免疫階段實驗凑懂，進入建庫篩選階段。

保密性說明

南京華鼎生物擁有眾多商業(yè)合作伙伴梧宫，深知保密工作對這些公司的重要性接谨，我們極度重視保密性摆碉，在與您溝通之前先簽署保密協(xié)議，并采用多重的防火墻及保障舉措脓豪，以保護您的隱私權(quán)巷帝。

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