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01. 背景介紹

因此需要開(kāi)發(fā)新型納米材料作為識(shí)別分子模擬抗體并與靶株結(jié)合蛙埂。例如倦畅，利用有機(jī)框架作為捕獲元素，可以有效地提高ICA系統(tǒng)的靈敏度绣的。引入對(duì)巰基苯基硼酸修飾的納米材料代替?zhèn)鹘y(tǒng)探針叠赐，可以表現(xiàn)出良好的細(xì)菌捕獲能力。同時(shí)屡江，二維納米材料芭概，如過(guò)渡金屬二硫族化合物和石墨烯，具有較大的表面積和較強(qiáng)的表面吸附能力惩嘉。這些二維納米片可以通過(guò)其大表面罢洲，依靠范德華力、靜電和疏水相互作用非特異性地結(jié)合細(xì)菌文黎。因此惹苗，這些獨(dú)特的性質(zhì)使這些二維納米材料有可能在ICA中取代傳統(tǒng)探針作為抗體替代者。

納米酶耸峭，是具有類(lèi)酶特性的納米材料桩蓉，是優(yōu)秀的信號(hào)報(bào)告分子而被廣泛應(yīng)用于生物傳感檢測(cè)，治療等領(lǐng)域抓艳。MnO2作為一種有前途的納米材料因其形貌多樣性和制備簡(jiǎn)單触机，獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)、吸附能力和優(yōu)異的催化性能得到廣泛研究玷或，因此二維MnO2 NSs是無(wú)標(biāo)記ICA的理想標(biāo)簽儡首。

本研究首先利用具有良好細(xì)菌吸附能力、良好光信號(hào)和催化活性的MnO2 NSs作為無(wú)捕獲抗體探針偏友，設(shè)計(jì)了一種新型的無(wú)標(biāo)記雙信號(hào)ICA蔬胯，用于靈敏快速檢測(cè)腸炎沙門(mén)氏菌(S. enteritidis)。眾所周知位他，腸炎沙門(mén)氏菌是致病菌引起的傳染病的主要危險(xiǎn)因素之一氛濒。一般來(lái)說(shuō)产场，它可以通過(guò)食用受污染的動(dòng)物源性食品(如肉、蛋和牛奶)傳播給人類(lèi)舞竿，導(dǎo)致數(shù)百萬(wàn)人患病京景，有時(shí)甚至造成嚴(yán)重和致命的后果。在這項(xiàng)工作中骗奖，僅使用一個(gè)單抗就能成功檢測(cè)出腸炎沙門(mén)氏菌确徙，具有良好的靈敏度和選擇性。通過(guò)一步合成二維MnO2 NSs执桌，可以同時(shí)提供三個(gè)功能:(1)作為細(xì)菌捕獲的抗體替代者鄙皇，(2)在ICA中提供強(qiáng)大的視覺(jué)信號(hào)，(3)通過(guò)浸泡放大模擬酶氧化酶活性產(chǎn)生額外的催化信號(hào)仰挣。因此伴逸，它已被選擇并引入ICA作為檢測(cè)食源性病原體的理想標(biāo)簽。如方案1所示膘壶，在檢測(cè)過(guò)程中错蝴，在測(cè)試樣品中加入適量的MnO2 NSs，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的孵育后香椎，MnO2 NSs會(huì)吸附在目標(biāo)菌表面形成細(xì)菌材料復(fù)合物漱竖。然后，在毛細(xì)管力的作用下畜伐，復(fù)合物會(huì)從樣品墊遷移到NC膜上。當(dāng)復(fù)合物移動(dòng)到T線時(shí)躺率，預(yù)涂的抗S. enteritidis抗體會(huì)特異性結(jié)合檢測(cè)靶點(diǎn)玛界，并在T線上富集，形成棕色條帶悼吱。因此慎框，測(cè)試物質(zhì)中目標(biāo)細(xì)菌越多，T線顏色越深后添，呈正線性關(guān)系笨枯。此外，由于MnO2 NSs具有類(lèi)似氧化酶的酶活性遇西，TMB會(huì)被氧化為ox-TMB馅精，形成藍(lán)帶，從而提高檢測(cè)靈敏度粱檀。

要點(diǎn): 通過(guò)透射電鏡(TEM)對(duì)制備的MnO2 NSs形貌進(jìn)行表征洲敢，可以看出MnO2 NSs為二維片狀結(jié)構(gòu)，平均尺寸約為250 nm(圖1a和圖1b)茄蚯。MnO2納米顆粒表面元素組成和化學(xué)狀態(tài)的XPS全光譜如圖所示压彭，揭示了MnO2 NSs中存在Mn和O元素睦优。此外，Mn 2p光譜的高分辨光譜(圖1e)在653.9 eV和642.0 eV處的兩個(gè)主峰分別歸屬于Mn 2p1/2和Mn 2p3/2軌道的Mn3+和Mn4+壮不，這與之前報(bào)道的發(fā)現(xiàn)一致汗盘。在較高的Mn3+比例下，有更多的氧空位询一，使得制備的MnO2 NSs具有較高的催化活性衡未。用x射線衍射(XRD)測(cè)定了合成的二氧化錳NSs的晶體結(jié)構(gòu)。如圖1c所示家凯，XRD譜圖顯示缓醋，在22.01、37.32绊诲、39.69送粱、56.03和65.81?的2θ處分別形成(110)、(101)掂之、(200)抗俄、(211)和(002)，與γ-MnO2的特征峰一致(PDF# 65-2821)世舰。以上結(jié)果證明了二氧化錳納米顆粒的成功制備动雹。圖1g顯示，大量MnO2 NSs在腸炎沙門(mén)氏菌表面結(jié)合跟压。這些結(jié)果表明MnO2 NSs具有與腸炎沙門(mén)氏菌相互作用的能力胰蝠。圖1i顯示了MnO2 NSs、S. enteritidis和MnO2 NSs- S. enteritidis的電位震蒋。顯然茸塞，與腸炎沙門(mén)氏菌結(jié)合后，電位從-31.77變?yōu)?23.50 mV查剖。

要點(diǎn)：所制備的二氧化錳納米酶的類(lèi)似氧化酶的催化活性是實(shí)現(xiàn)原位放大比色信號(hào)的關(guān)鍵性質(zhì)钾虐。圖片顯示MnO2 NSs氧化TMB生成藍(lán)色氧化產(chǎn)物，在650 nm處出現(xiàn)明顯的吸收峰(紅線)笋庄。同時(shí)效扫，在沒(méi)有MnO2 NSs的情況下，TMB沒(méi)有被氧化直砂，溶液保持無(wú)色菌仁，在600-700 nm處沒(méi)有出現(xiàn)峰(藍(lán)線)。進(jìn)一步哆键，從圖2b可以看出掘托，隨著MnO2 NSs濃度的增加，催化體系的吸光度逐漸增大籍嘹，納米酶的濃度與吸光度呈線性關(guān)系(圖2c)闪盔。這些結(jié)果表明所制備的MnO2 NSs具有類(lèi)似氧化酶的活性弯院，可以催化TMB生成ox-TMB并觸發(fā)視覺(jué)顏色信號(hào)。不同pH值下MnO2 NSs的催化能力不同泪掀。如圖2d所示听绳，當(dāng)緩沖體系的pH為5時(shí)，催化活性最佳异赫。此外椅挣，MnO2納米酶耐極端溫度，在30-100℃范圍內(nèi)催化活性沒(méi)有明顯變化塔拳，表明MnO2納米酶比天然酶具有更高的耐溫性(圖2e)鼠证。根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)方程，可以定量評(píng)價(jià)MnO2 NSs的氧化酶活性靠抑。Km表示酶對(duì)底物的結(jié)合親和力量九，Vmax表示酶的周轉(zhuǎn)數(shù)，反映酶的生物催化活性颂碧。不同TMB濃度下MnO2 NSs的類(lèi)氧化酶催化活性如圖2f所示荠列。測(cè)得MnO2 NSs的Km和Vmax分別為0.447 mM和14.9 × 10-8 Ms-1。與先前報(bào)道的一些復(fù)合納米酶相比载城，MnO2 NSs的催化活性相當(dāng)肌似，甚至更好。以上結(jié)果證明類(lèi)氧化酶MnO2 NSs具有相對(duì)穩(wěn)定的催化性能诉瓦，有利于構(gòu)建穩(wěn)定的MnO2納米酶介導(dǎo)的視覺(jué)生物傳感器川队。

要點(diǎn)：免疫層析分析的效果取決于合適的檢測(cè)條件。因此垦搬，在107 cfu?mL-1腸炎沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)溶液中呼寸，選擇MnO2 NSs的濃度和體積、孵育時(shí)間和免疫反應(yīng)時(shí)間作為關(guān)鍵檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化猴贰。

要點(diǎn)：如圖直觀觀察到，在0 ~ 104 cfu?mL-1的檢測(cè)范圍內(nèi)河狐，隨著細(xì)菌濃度的增加米绕，T線上的棕色明顯加深。當(dāng)腸炎沙門(mén)氏菌濃度小于104 cfu?mL-1時(shí)馋艺，肉眼很難區(qū)分檢測(cè)區(qū)域的顏色變化栅干。進(jìn)一步，受納米酶介導(dǎo)的信號(hào)放大的啟發(fā)捐祠，現(xiàn)有的檢測(cè)結(jié)果被催化放大碱鳞。催化后T線呈藍(lán)色，檢測(cè)范圍擴(kuò)大10倍踱蛀。獨(dú)立于其他設(shè)備窿给，基于目測(cè)讀數(shù)的檢測(cè)限(LOD)在催化前后分別為104和103 cfu?mL-1贵白，具有優(yōu)異的靈敏度，可以滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和快速讀數(shù)的需要崩泡。Image J軟件分析顯示禁荒，T線顏色強(qiáng)度與腸炎沙門(mén)氏菌濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系，可表示為y = 1837.55x-6681.89 (R2 = 0.988)角撞，可對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行定量分析呛伴。在圖片中，催化產(chǎn)生的比色信號(hào)也與腸炎沙門(mén)氏菌濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系:y = 2009.80x-5102.21 (R2 = 0.979)谒所。

為了驗(yàn)證MnO2 NSs - ICA的特異性热康，對(duì)分析物與一系列干擾菌進(jìn)行了交叉反應(yīng)試驗(yàn)。如圖所示劣领，雖然干擾菌的濃度(108 cfu?mL-1)比腸炎沙門(mén)氏菌的濃度(107 cfu?mL-1)高10倍姐军，但這些干擾菌對(duì)應(yīng)的T線沒(méi)有明顯的信號(hào)。此外剖踊，在催化著色后庶弃，干擾菌株的T線仍無(wú)明顯信號(hào)，表明該新型生物傳感器對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌具有良好的選擇性德澈。

要點(diǎn)：為了驗(yàn)證所開(kāi)發(fā)的MnO2 NSs ICA的實(shí)際應(yīng)用歇攻，選取了幾個(gè)實(shí)際樣品進(jìn)行了測(cè)試。如圖所示梆造，對(duì)于不同的食品樣品缴守，測(cè)試結(jié)果與緩沖系統(tǒng)中的測(cè)試結(jié)果一致。隨著細(xì)菌濃度的降低镇辉，T線棕色帶的強(qiáng)度逐漸變?nèi)趼潘耄钡椒謩e在橙汁、飲用水忽肛、牛奶和牛肉的LOD濃度為104村砂、104、104和105 cfu?mL-1時(shí)停止屹逛。在TMB催化著色后础废，上述樣品的LOD分別為103、103罕模、103和104 cfu?mL-1评腺，降低了10倍。

腸炎沙門(mén)氏菌免疫層析檢測(cè)的LOD為103 cfu?mL-1，線性范圍為103 -107 cfu?mL-1舷夺。ICA已成功應(yīng)用于橙汁苦酱、飲用水、牛奶给猾、牛肉樣品中腸炎沙門(mén)氏菌的檢測(cè)疫萤。綜上所述，新型ICA在病原菌檢測(cè)中具有普遍適用性敢伸，具有制備工藝簡(jiǎn)單扯饶、檢測(cè)速度快、經(jīng)濟(jì)池颈、靈活尾序、便于推廣應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)。遺憾的是躯砰，由于沒(méi)有控制線每币，該平臺(tái)可能會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，我們正在進(jìn)行后續(xù)工作來(lái)彌補(bǔ)這一不足琢歇。