CRISPR/Cas12結(jié)合反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)進(jìn)行可視化多重靶標(biāo)檢測(cè)
- 2023 - 12 - 19
作者在CRISPR-RDB體系中采用了Cas12a拂共，利用Cas12a在靶標(biāo)識(shí)別后表現(xiàn)出的針對(duì)非特異單鏈DNA的反式剪切活性實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)牺弄。首先，作者設(shè)計(jì)了四條序列不同的Biotin-recognition DNA（recDNA I宜狐、II势告、III和IV），及其相應(yīng)的序列互補(bǔ)的捕獲DNA（capDNA I抚恒、Ⅱ咱台、III和Ⅳ）。recDNA I俭驮、II回溺、III和IV分別與識(shí)別不同靶標(biāo)序列的Cas12a/crRNA復(fù)合物孵育，形成單獨(dú)的反應(yīng)單元混萝。將待測(cè)樣本分別加入這4個(gè)反應(yīng)單元遗遵，在對(duì)應(yīng)靶標(biāo)存在的情況下，Cas12a被激活并反式剪切recDNA譬圣；在對(duì)應(yīng)靶標(biāo)不存在的情況下瓮恭，Cas12a不會(huì)被反式激活，相應(yīng)的recDNA保持完整厘熟。反應(yīng)結(jié)束后屯蹦，將4個(gè)反應(yīng)單元的產(chǎn)物混合，并與尼龍膜上包被的capDNA I绳姨、Ⅱ登澜、III和Ⅳ孵育，完整的recDNA能與對(duì)應(yīng)的capDNA互補(bǔ)結(jié)合飘庄，從而引入Biotin標(biāo)記脑蠕。Biotin標(biāo)記的recDNA：capDNA雙鏈可以結(jié)合streptavidin-HRP，將無色的TMB底物轉(zhuǎn)化為藍(lán)色。因此谴仙，藍(lán)色指示對(duì)應(yīng)靶標(biāo)不存在迂求；而白色指示對(duì)應(yīng)靶標(biāo)存在，且recDNA全部被反式剪切晃跺。
02揩局、CRISPR-RDB的可行性分析
為了驗(yàn)證CRISPR-RDB體系的可行性，作者先將4種recDNA和4種capDNA雜交掀虎，結(jié)果表明每條帶有4種capDNA的尼龍膜可識(shí)別到對(duì)應(yīng)的recDNA静汤，且recDNA I裳擎、II、III和IV之間沒有干擾。 同時(shí)瓷式，作者測(cè)試了4個(gè)具有不同靶標(biāo)序列識(shí)別能力的Cas12a/crRNA系統(tǒng)潦俺，顯示能夠在特異靶標(biāo)存在的情況下剪切對(duì)應(yīng)的recDNA曼玩。
接下來僧凰，為了進(jìn)行臨床檢測(cè)探索，作者將4重靶標(biāo)分別設(shè)置為甲型流感病毒（FA）址儒、乙型流感病毒（FB）芹枷、呼吸道合胞病毒（RSV）和嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2型（SARS-CoV-2）的部分序列，并搭建了簡(jiǎn)易的4通道微流控芯片莲趣。隨后鸳慈，作者模擬了FA、FB喧伞、RSV走芋、SARS-CoV-2這4種靶標(biāo)序列的多種可能性組合（包括同時(shí)存在0種，1種潘鲫，2種翁逞，3種，甚至4種靶標(biāo)）溉仑，結(jié)果表明CRISPR-RDB體系能夠檢測(cè)到以上所有組合情況挖函。而且，使用智能手機(jī)應(yīng)用程序?qū)Σ煌瑵舛鹊陌袠?biāo)DNA（0浊竟、5怨喘、10、30 nM）進(jìn)行藍(lán)點(diǎn)顏色識(shí)別振定，可以觀察到靶標(biāo)濃度與藍(lán)點(diǎn)的顏色深淺呈反比必怜，由此可以進(jìn)行靶標(biāo)濃度的相對(duì)定量。
03后频、CRISPR-RDB關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化
為了提升CRISPR-RDB體系的檢測(cè)性能梳庆，作者對(duì)其中的關(guān)鍵因素進(jìn)行了優(yōu)化暖途，確認(rèn)尼龍膜承載體積（每個(gè)正方形尺寸為0.5 cm×0.6 cm）為1 μL；capDNA（1 μL膏执，10 μM）和recDNA（75 nM）之間雜交條件為35℃驻售，40 min；Cas12a濃度對(duì)為100 nM胧后；HRP孵育時(shí)間為20 min芋浮。
04、CRISPR-RDB檢測(cè)性能
在上述優(yōu)化的關(guān)鍵參數(shù)條件下壳快，作者進(jìn)一步測(cè)試了CRISPR-RDB體系的檢測(cè)性能。作者采用RPA預(yù)擴(kuò)增的方案進(jìn)行靶標(biāo)富集镇草，隨后用CRISPR-RDB體系對(duì)靶標(biāo)濃度進(jìn)行相對(duì)定量眶痰。如圖展示了針對(duì)4種靶標(biāo)病毒的RPA引物和crRNA設(shè)計(jì)方案。隨后梯啤，對(duì)不同濃度（0竖伯、2.5、5因宇、10七婴、15、20 nM）靶標(biāo)DNA進(jìn)行檢測(cè)察滑，隨著各靶標(biāo)DNA濃度的增加打厘，4個(gè)通道中的藍(lán)點(diǎn)強(qiáng)度相應(yīng)地逐漸變?nèi)酢Ｊ褂弥悄苁謾C(jī)應(yīng)用程序?qū)σ幌盗邪袠?biāo)DNA濃度進(jìn)行相對(duì)量化贺辰，結(jié)果顯示在2.5–20 nM范圍內(nèi)具有良好的線性户盯。進(jìn)一步評(píng)估CRISPR-RDB對(duì)真實(shí)病毒樣品的檢測(cè)靈敏度，結(jié)果顯示對(duì)不同濃度（0饲化、2莽鸭、4、6吃靠、8硫眨、10和100個(gè)拷貝）FA、FA巢块、RSV和SARS-CoV-2樣本有梯度檢測(cè)結(jié)果礁阁，且檢測(cè)限低至4個(gè)拷貝/μL。
為了測(cè)試CRISPR-RDB檢測(cè)體系的特異性夕冲，作者首先證明4種病毒靶標(biāo)都可以被對(duì)應(yīng)的Cas12a/crRNA特異識(shí)別氮兵，具有較高的選擇性；進(jìn)一步地歹鱼，作者在靶標(biāo)序列中引入2個(gè)突變堿基后泣栈，結(jié)果表明2個(gè)位點(diǎn)錯(cuò)配會(huì)導(dǎo)致Cas12a反式剪切活性的顯著降低，說明CRISPR-RDB檢測(cè)體系具有較高的特異性。此外南片，作者還測(cè)試了藍(lán)點(diǎn)在尼龍膜上的顯色穩(wěn)定性掺涛，結(jié)果表明4°C比25°C、37°C更有利于藍(lán)點(diǎn)顏色的穩(wěn)定保存疼进，這可能與單鏈DNA在較高的溫度更容易降解有關(guān)薪缆。因此，確認(rèn)尼龍膜顯色最佳存儲(chǔ)條件為4°C下不超過10天伞广，25°C下不超過3天拣帽。
05、CRISPR-RDB的臨床應(yīng)用
為了探索CRISPR-RDB在真實(shí)臨床樣本中的應(yīng)用嚼锄，作者展示了工作流程圖减拭。其從樣本到檢測(cè)結(jié)果的時(shí)長大約為105 min，檢測(cè)信號(hào)可以通過智能手機(jī)應(yīng)用程序或肉眼來讀取区丑。對(duì)23個(gè)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)（1號(hào)：陰性對(duì)照拧粪；2–6號(hào)：FA陽性樣本；7–11號(hào)：FB陽性樣本沧侥；12–16號(hào)：新冠病毒陽性樣本可霎；17–23號(hào)：呼吸道合胞病毒陽性樣本），并將檢測(cè)結(jié)果與qPCR對(duì)比宴杀，結(jié)果顯示癣朗，除19號(hào)樣本外，其它臨床樣本檢測(cè)結(jié)果一致婴氮。
隨后斯棒，作者使用含有FA、FB主经、RSV和SARS-CoV-2真實(shí)樣本的隨機(jī)混合來評(píng)估多通道性能（第1號(hào)：陰性對(duì)照荣暮；第2–7號(hào)：含有兩種病毒的樣本；第8–11號(hào)：含有三種病毒的樣本罩驻；第12號(hào)：含有四種病毒的樣本）穗酥，結(jié)果顯示CRISPR-RDB對(duì)單個(gè)或多個(gè)混合靶標(biāo)都表現(xiàn)出高靈敏度和特異性，證明了其在多重核酸檢測(cè)領(lǐng)域的潛力惠遏。
高危HPV的持續(xù)感染會(huì)導(dǎo)致全球女性第二常見的惡性腫瘤砾跃，侵襲性子宮頸癌的主要高危HPV基因型為HPV 16、18节吮、31抽高、33、35透绩、45翘骂、52和58壁熄。目前，PCR-RDB作為一種常見的診斷方法已被廣泛應(yīng)用于HPV類型的精確鑒定碳竟。作者基于CRISPR-RDB策略草丧，構(gòu)建了針對(duì)高致病性類型HPV 16、18莹桅、52和58的4通道診斷方法昌执。該方法不僅比傳統(tǒng)的PCR-RDB更加省時(shí)（105 minVS PCR-RDB的290 min），而且所需的儀器也非常簡(jiǎn)單诈泼。為了驗(yàn)證其多重核酸診斷性能懂拾，作者優(yōu)先使用商業(yè)PCR-RDB試劑盒測(cè)試了5個(gè)樣本，隨后使用CRISPR-RDB平臺(tái)對(duì)確認(rèn)的臨床樣本進(jìn)行測(cè)試铐达，獲得了與PCR-RDB一致的檢測(cè)結(jié)果委粉。這充分說明了CRISPR-RDB作為一個(gè)平臺(tái)型檢測(cè)策略應(yīng)用于多重核酸檢測(cè)的巨大潛力。
總的來說娶桦，CRISPR-RDB平臺(tái)可通過使用掌心型微流控芯片和尼龍膜進(jìn)行可視化信號(hào)讀出，且能用于同時(shí)檢測(cè)多重核酸靶標(biāo)汁汗。與金標(biāo)準(zhǔn)qPCR進(jìn)行比較衷畦，CRISPR-RDB平臺(tái)顯示出對(duì)臨床樣本高度一致的檢測(cè)結(jié)果；與PCR-RDB相比知牌，其檢測(cè)時(shí)間節(jié)省了2/3祈争。因此，CRISPR-RDB平臺(tái)可能在未來為多重核酸檢測(cè)提供一種簡(jiǎn)單角寸、通用菩混、經(jīng)濟(jì)高效的解決方案。
參考文獻(xiàn)：Hu T, Ke X, Li W, Lin Y, Liang A, Ou Y, Chen C. CRISPR/Cas12a-Enabled Multiplex Biosensing Strategy Via an Affordable and Visual Nylon Membrane Readout.Adv Sci (Weinh). 2023 Jan;10(2):e2204689. doi: 10.1002/advs. 202204689. Epub 2022 Nov 28. PMID: 36442853; PMCID: PMC9839848.
